Eseesega o alava maso o le tagata i tua atu o le filifili mamafa o le myosin

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O maso o le skeletal o se aano eseese e aofia ai myofibrils, lea i tagata e masani ona vaevaeina i ni ituaiga se tolu: tasi "lemu" (ituaiga 1) ma lua "vave" (ituaiga 2A ma le 2X). Ae ui i lea, o le eseesega i le va ma totonu o ituaiga myofibril masani e le o malamalama lelei i ai. Na matou faʻaaogaina auala transcriptomic ma proteomic i le 1050 ma le 1038 myofibrils taʻitasi mai le vastus lateralis o le tagata. O le suʻesuʻega proteomic na aofia ai alii, ma le suʻesuʻega transcriptomic na aofia ai alii e 10 ma tamaitai e 2. I le faaopoopo atu i isoforms o le myosin heavy chain, na matou faailoa mai ai porotini metabolic, porotini ribosomal, ma porotini cellular junctional o ni punaoa o le eseesega o le intermyofibril multidimensional. E le gata i lea, e ui lava i le faailoaina o faaputuga o alava lemu ma vave, o a matou faamatalaga e fautua mai ai o alava ituaiga 2X e le mafai ona iloa le eseesega mai isi alava vave-twitch. E le gata i lea, o le faavasegaina e faavae i luga o le myosin heavy chain e le lava e faamatala ai le phenotype o le myofiber i nemaline myopathies. I le aotelega, o a matou faʻamaumauga o loʻo fautua mai ai le tele o itu o le myofiber heterogeneity, faatasi ai ma punaoa o fesuiaiga e sili atu nai lo myosin heavy chain isoforms.
O le eseesega o sela o se uiga masani lea o faiga ola uma, e mafai ai e sela ona faʻapitoa e faʻafetaui manaʻoga eseese o aano ma sela.1 O le manatu masani o le eseesega o alava o maso skeletal o le faʻamatalaina lea e neurons afi le ituaiga alava i totonu o se iunite afi, ma o le ituaiga alava (e pei o le ituaiga 1, ituaiga 2A, ma le ituaiga 2X i tagata) e fuafuaina e uiga i le myosin heavy chain (MYH) isoforms.2 Na muamua faʻavae lenei mea i luga o le le mautu o le pH ATPase,3,4 ma mulimuli ane i luga o la latou faʻaaliga molecular o le MYH.5 Peitaʻi, faʻatasi ai ma le faʻailoaina ma le taliaina mulimuli ane o alava "fefiloi" e faʻaalia faʻatasi ai le tele o MYH i vaega eseese, o alava o maso skeletal ua faʻateleina le vaʻaia o se faʻaauau nai lo o ni ituaiga alava eseese.6 E ui i lea, o loʻo faʻalagolago pea le fanua i le MYH o le faʻavasegaga autu mo le faʻavasegaina o myofiber, o se manatu e foliga mai na aʻafia i tapulaʻa ma faʻaituʻau taua o suʻesuʻega muamua o isumu o latou faʻamatalaga MYH ma le tele o ituaiga alava e ese mai i tagata.2 O le tulaga ua sili atu ona faigata ona o le mea moni e faʻaalia e maso skeletal eseese o tagata le tele o ituaiga alava.7 O le vastus lateralis o se maso fefiloi ma se fa'atulagaga fa'aleoga o le MYH (ma o lea la e fai ma sui).7 E le gata i lea, o lona faigofie ona fa'ata'ita'iina e avea ai ma maso e sili ona su'esu'eina i tagata.
O le mea lea, o le suʻesuʻega e le faʻaituau i le eseesega o alava o maso skeletal e faʻaaogaina ai meafaigaluega malolosi "omics" e taua tele ae faigata foi, ona o le natura tele o alava o maso skeletal. Peitaʻi, o tekinolosi transcriptomics8,9 ma proteomics10 ua i ai se suiga tele i le lagona i tausaga talu ai nei ona o le tele o alualu i luma faatekinolosi, ma mafai ai ona suʻesuʻeina maso skeletal i le iugafono o le alava e tasi. O se taunuuga, ua faia ni alualu i luma taua i le faʻailoaina o le eseesega o alava e tasi ma a latou tali atu i faʻaosofiaga atrophic ma le matua11,12,13,14,15,16,17,18. O le mea taua, o nei alualu i luma faatekinolosi e iai a latou faʻaoga faafomaʻi, ma mafai ai ona faʻamatalaina atili auiliili ma saʻo le faʻaletonu e fesoʻotaʻi ma faʻamaʻi. Mo se faʻataʻitaʻiga, o le pathophysiology o le nemaline myopathy, o se tasi o faʻamaʻi maso e masani ona maua mai i le tofi (MIM 605355 ma le MIM 161800), e lavelave ma fenumiai.19,20 O le mea lea, o se faʻamatalaga sili atu o le faʻaletonu o alava o maso skeletal e mafai ona oʻo atu ai i alualu i luma taua i lo tatou malamalama i lenei faʻamaʻi.
Na matou atiaʻe ni metotia mo le suʻesuʻega transcriptomic ma proteomic o alava maso skeletal e tasi na vavaeʻeseina ma le lima mai faʻataʻitaʻiga biopsy o tagata ma faʻaaogaina i le faitau afe o alava, ma mafai ai ona matou suʻesuʻeina le heterogeneity o sela o alava maso skeletal o tagata. I le gasologa o lenei galuega, na matou faʻaalia ai le mana o le transcriptomic ma le proteomic phenotyping o alava maso ma faʻailoa ai metabolic, ribosomal, ma cellular junctional proteins o ni puna taua o le eseesega o interfiber. E le gata i lea, i le faʻaaogaina o lenei proteomic workflow, na matou faʻamatalaina ai le taua faʻapitoa o le nematode myopathy i alava maso skeletal e tasi, ma faʻaalia ai se suiga faʻatasi agai i alava e le o oxidative e tutoʻatasi mai le ituaiga alava e faʻavae i luga o le MYH.
Ina ia suʻesuʻeina le eseesega o alava o maso o le tino o le tagata, na matou atiaʻeina ni auala faigaluega se lua e mafai ai ona faia le suʻesuʻega o le transcriptome ma le proteome o alava o maso o le tino e tasi (Ata 1A ma le Ata Faʻaopoopo 1A). Na matou atiaʻe ma faʻaleleia ni laʻasaga faʻatino, mai le teuina o faʻataʻitaʻiga ma le faʻasaoina o le RNA ma le atoatoa o porotini i le faʻaleleia atili o le gaosiga mo auala taʻitasi. Mo le suʻesuʻega o le transcriptome, na ausia lenei mea e ala i le faʻaofiina o barcode molecular faʻapitoa mo faʻataʻitaʻiga i le laʻasaga muamua o le faʻaliliuga faʻafeagai, ma faʻatagaina ai le 96 alava e tuʻufaʻatasia mo le faʻagasologa lelei i lalo. O le faʻasologa loloto (±1 miliona faitauga i le alava) pe a faʻatusatusa i auala masani o le sela e tasi na faʻamauoa atili ai faʻamatalaga o le transcriptome. 21 Mo proteomics, na matou faʻaaogaina se gradient chromatographic puʻupuʻu (21 minute) faʻatasi ai ma le mauaina o faʻamatalaga DIA-PASEF i luga o le timsTOF mass spectrometer e faʻaleleia atili ai le loloto o le proteome aʻo faʻatumauina pea le gaosiga maualuga. 22,23 Ina ia suʻesuʻeina le eseesega o alava maloloina o maso skeletal, na matou faʻamatalaina ai transcriptomes o alava taʻitasi e 1,050 mai tagata matutua e 14 e soifua maloloina ma proteomes o alava e 1,038 mai tagata matutua e 5 e soifua maloloina (Faʻaopoopoga Laulau 1). I totonu o lenei pepa, o nei faʻamaumauga e taʻua o transcriptomes ma proteomes e 1,000-alava. Na iloa e la matou auala le aofaʻi o transcripts e 27,237 ma porotini e 2,983 i le 1,000-alava transcriptomic ma proteomic analysis (Ata 1A, Faʻaopoopoga Faʻamaumauga 1–2). Ina ua maeʻa ona faʻamamāina faʻamaumauga transcriptomic ma proteomic mo le >1,000 genes na iloa ma le 50% o tau aoga i le alava, na faia ai suʻesuʻega bioinformatics mulimuli ane mo alava e 925 ma le 974 i le transcriptome ma le proteome. A maeʻa ona faʻamamāina, o le averesi o le 4257 ± 1557 genes ma le 2015 ± 234 porotini (averesi ± SD) na iloa i le alava taʻitasi, faʻatasi ai ma le eseesega faʻatapulaʻaina i le va o tagata taʻitoʻatasi (Ata Faʻaopoopo 1B–C, Seti Faʻaopoopo 3–4). Peitaʻi, o le eseesega i totonu o mataupu sa sili atu ona iloga i tagata auai, atonu ona o eseesega i le RNA/porotini i le va o alava o umi eseese ma vaega faʻalava. Mo le tele o porotini (>2000), o le coefficient of variation sa i lalo ifo o le 20% (Ata Faʻaopoopo 1D). O auala uma e lua na mafai ai ona puʻeina se lautele lautele o transcripts ma porotini ma faʻailoga maualuga o loʻo taua mo le faʻaitiitia o maso (e.g., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Ata Faʻaopoopo 1E–F). O le tele o foliga na faʻailoaina sa tutusa i le va o faʻamaumauga transcriptomic ma proteomic (Ata Faʻaopoopo 1G), ma o le averesi o le malosi o le UMI/LFQ o nei foliga sa fetaui lelei (r = 0.52) (Ata Faʻaopoopo 1H).
O le fa'agasologa o galuega a le transcriptomics ma le proteomics (na fatuina i le BioRender.com). BD Dynamic range curves mo le MYH7, MYH2, ma le MYH1, ma le fuafuaina o tapula'a mo le tofiaina o ituaiga fiber. E, F Tu'ufa'atasiga o le fa'aalia o le MYH i luga o fiber i totonu o fa'amaumauga o le transcriptomics ma le proteomics. G, H Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP) plots mo le transcriptomics ma le proteomics na valiina e le ituaiga fiber fa'avae i le MYH. I, J Feature plots o lo'o fa'aalia ai le fa'aalia o le MYH7, MYH2, ma le MYH1 i totonu o fa'amaumauga o le transcriptomics ma le proteomics.
Na matou fa'atulaga muamua e tofia le ituaiga o alava e fa'avae i luga o le MYH i alava ta'itasi e fa'aaoga ai se auala fa'alelei e fa'aaogaina ai le maualuga o le maaleale ma le lautele o le fa'aalia o le MYH i fa'amaumauga omics. O su'esu'ega na faia muamua na fa'aogaina ai ni tapula'a fa'afuase'i e fa'ailoga ai alava o le ituaiga mama 1, ituaiga 2A, ituaiga 2X, po'o le fefiloi e fa'atatau i se pasene mautu o le fa'aalia o MYHs eseese11,14,24. Na matou fa'aogaina se auala ese lea na fa'avasega ai le fa'aalia o alava ta'itasi e ala i MYHs na matou fa'aaogaina e fa'avasega ai alava: MYH7, MYH2, ma le MYH1, e tutusa ma alava ituaiga 1, ituaiga 2A, ma le ituaiga 2X, i le fa'asologa. Ona matou fuafuaina lea fa'amatematika le tulaga maualalo o le inflection o pi'o ta'itasi ma fa'aaoga o se tapula'a e tofia ai alava o le lelei (i luga a'e o le tapula'a) po'o le leaga (i lalo ifo o le tapula'a) mo MYH ta'itasi (Ata 1B–D). O nei fa'amaumauga e fa'aalia ai o le MYH7 (Ata 1B) ma le MYH2 (Ata 1C) e sili atu ona manino le fa'aalia o le on/off i le tulaga RNA pe a fa'atusatusa i le tulaga porotini. E moni, i le tulaga o le porotini, e na o ni nai alava e leʻi faʻaalia le MYH7, ma e leai se alava e 100% le faʻaalia o le MYH2. Ona matou faʻaaogaina lea o tapulaʻa faʻaalia ua uma ona fuafuaina e tofia ai ituaiga alava e faʻavae i le MYH i alava uma i faʻamaumauga taʻitasi. Mo se faʻataʻitaʻiga, o alava MYH7+/MYH2-/MYH1- na tofia i le ituaiga 1, aʻo alava MYH7-/MYH2+/MYH1+ na tofia i le ituaiga fefiloi 2A/2X (tagai i le Faʻaopoopoga Laulau 2 mo le faʻamatalaga atoa). I le tuʻufaʻatasia o alava uma, na matou matauina ai se tufatufaga tutusa o ituaiga alava e faʻavae i le MYH i tulaga uma e lua o le RNA (Ata 1E) ma le porotini (Ata 1F), aʻo le tuufaatasiga faʻatatau o ituaiga alava e faʻavae i le MYH e eseese i tagata taʻitoʻatasi, e pei ona faʻamoemoeina (Ata Faʻaopoopo 2A). O le tele o alava na faʻavasegaina o le ituaiga mama 1 (34–35%) poʻo le ituaiga 2A (36–38%), e ui lava o se numera tele o alava fefiloi 2A/2X na iloa foi (16–19%). O se eseesega mataʻina, o alava mama ituaiga 2X e naʻo le tulaga RNA e mafai ona iloa, ae le o le tulaga porotini, o loʻo faʻaalia ai o le vave o le faʻaalia o le MYH e faʻatonutonuina i se vaega pe a uma le faʻaliliuga.
Na matou faʻamaonia la matou metotia o le faʻavasegaina o le MYH fiber e faʻavae i luga o le proteomics e faʻaaoga ai le antibody-based dot blotting, ma o metotia uma e lua na ausia le 100% o le maliliega i le faʻailoaina o le ituaiga mama 1 ma le ituaiga 2A fibers (tagai i le Faʻaopoopoga Ata 2B). Peitaʻi, o le auala e faʻavae i luga o le proteomics sa sili atu ona maaleale, sili atu ona lelei i le faʻailoaina o fibers fefiloi, ma le fuaina o le vaega o gene MYH taʻitasi i fiber taʻitasi. O nei faʻamaumauga e faʻaalia ai le aoga o le faʻaaogaina o se auala faʻapitoa, maaleale tele e faʻavae i luga o le omics e faʻailoa ai ituaiga fiber maso skeletal.
Ona matou faʻaaogaina lea o faʻamatalaga tuʻufaʻatasi na tuʻuina mai e le transcriptomics ma le proteomics e faʻavasega ai myofibers e faʻavae i luga o latou transcriptome atoa poʻo le proteome. I le faʻaaogaina o le metotia o le uniform manifold approximation and projection (UMAP) e faʻaitiitia ai le dimensionality i vaega autu e ono (Ata Faʻaopoopo 3A–B), na mafai ai ona matou vaʻaia le fesuiaʻiga o myofiber i le transcriptome (Ata 1G) ma le proteome (Ata 1H). E taua tele, o myofibers e leʻi faʻavasegaina e tagata auai (Ata Faʻaopoopo 3C–D) poʻo aso suʻega (Ata Faʻaopoopo 3E) i totonu o faʻamaumauga o le transcriptomics poʻo le proteomics, ma faʻailoa mai ai o le fesuiaʻiga i totonu o le tagata e sili atu nai lo le fesuiaʻiga i le va o tagata e sili atu. I le UMAP plot, e lua ni vaega eseese e fai ma sui o myofibers "vave" ma le "lemu" na aliaʻe mai (Ata 1G–H). O myofibers MYH7+ (lemu) na fa'aputuina i le pole lelei o le UMAP1, ae o myofibers MYH2+ ma MYH1+ (vave) na fa'aputuina i le pole leaga o le UMAP1 (Ata 1I–J). Peita'i, e leai se eseesega na faia i le va o ituaiga alava vave-twitch (e pei o le ituaiga 2A, ituaiga 2X, po'o le 2A/2X fefiloi) e fa'avae i luga o le fa'aaliga MYH, ma fa'ailoa mai ai o le fa'aaliga MYH1 (Ata 1I–J) po'o isi fa'ailoga masani o le 2X myofiber e pei o le ACTN3 po'o le MYLK2 (Ata Fa'aopoopo 4A–B) e le fa'ailoa mai ai le eseesega i le va o ituaiga myofiber eseese pe a mafaufau i le transcriptome atoa po'o le proteome. E le gata i lea, pe a fa'atusatusa i le MYH2 ma le MYH7, e na'o ni nai transcripts po'o porotini na feso'ota'i lelei ma le MYH1 (Ata Fa'aopoopo 4C–H), ma fa'ailoa mai ai o le tele o le MYH1 e le o atagia atoatoa ai le transcriptome/proteome o le myofiber. O fa'ai'uga fa'apena na o'o i ai i le iloiloina o le fa'aalia fa'afefiloi o isoforms e tolu o le MYH i le tulaga UMAP (Fa'aopoopoga Ata. 4I–J). O lea la, e ui e mafai ona iloa alava 2X i le tulaga o le transcript e fa'avae i luga o le MYH quantification na'o ia, ae e le mafai ona iloa alava MYH1+ mai isi alava vave pe a mafaufau i le transcriptome atoa po'o le proteome.
I le avea ai o se suʻesuʻega muamua o le eseesega o alava lemu i tua atu o le MYH, na matou iloiloina ai porotini e fa ua faʻamautuina e faʻapitoa i ituaiga alava lemu: TPM3, TNNT1, MYL3, ma le ATP2A22. O ituaiga alava lemu na faʻaalia ai le maualuga, e ui lava e le atoatoa, o fesoʻotaʻiga a Pearson ma MYH7 i le transcriptomics (Ata Faʻaopoopo 5A) ma le proteomics (Ata Faʻaopoopo 5B). E tusa ma le 25% ma le 33% o alava lemu e leʻi faʻavasegaina o ni alava lemu mama e ala i ituaiga kenera/porotini uma i le transcriptomics (Ata Faʻaopoopo 5C) ma le proteomics (Ata Faʻaopoopo 5D), i le faasologa. O le mea lea, o le faʻavasegaina o alava lemu e faʻavae i luga o le tele o ituaiga kenera/porotini e faʻaopoopoina ai le faigata faʻaopoopo, e oʻo lava i porotini e iloa e faʻapitoa i ituaiga alava. O lenei mea e faʻaalia ai o le faʻavasegaina o alava e faʻavae i luga o isoforms o se aiga kenera/porotini e tasi atonu e le o atagia lelei ai le eseesega moni o alava maso skeletal.
Mo se suʻesuʻega atili i le eseesega o le phenotypic o alava o maso o le tagata i le fua o le faʻataʻitaʻiga atoa omics, na matou faia ai le faʻaitiitia o le faʻaituau o le faʻamaumauga e faʻaaoga ai le auʻiliʻiliga o vaega autu (PCA) (Ata 2A). E tutusa ma ata o le UMAP, e leai se tasi o le au auai poʻo le aso o suʻega na aʻafia ai le faʻaputuina o alava i le tulaga PCA (Ata Faʻaopoopo 6A–C). I faʻamaumauga uma e lua, o le ituaiga alava e faʻavae i luga o le MYH na faʻamatalaina e le PC2, lea na faʻaalia ai se faʻaputuga o alava ituaiga 1 e lemu lemu ma se faʻaputuga lona lua o loʻo i ai le ituaiga vave lemu 2A, ituaiga 2X, ma alava fefiloi 2A/2X (Ata 2A). I ​​faʻamaumauga uma e lua, o nei faʻaputuga e lua na fesoʻotaʻi e se numera laʻititi o alava fefiloi ituaiga 1/2A. E pei ona faʻamoemoeina, o le auʻiliʻiliga o le faʻatusa o avetaʻavale autu o le PC na faʻamaonia ai o le PC2 na faʻatinoina e faʻailoga faʻasolosolo ma metabolic (Ata 2B ma Ata Faʻaopoopo 6D–E, Seti Faʻaopoopo 5–6). I le aotelega, o le ituaiga alava e faʻavae i le MYH na maua e lava lea e faʻamatalaina ai le suiga faifai pea i luga o le PC2, sei vagana ai alava e taʻua o le 2X ia na tufatufa atu i le transcriptome i totonu o le fast cluster.
A. Ata o le auiliiliga o vaega autū (PCA) o fa'amaumauga o le transcriptome ma le proteome ua valiina e tusa ai ma le ituaiga alava e fa'avae i luga o le MYH. B. Iloiloga fa'amauoa o avetaavale o le transcript ma le porotini i le PC2 ma le PC1. Sa faia le auiliiliga fa'amaumauga e fa'aaoga ai le afifi clusterProfiler ma Benjamini-Hochberg ua fetu'una'i p-values. C, D. Ata o le PCA ua valiina e tusa ai ma fa'aupuga o le intercellular adhesion gene ontology (GO) i le transcriptome ma fa'aupuga o le costamere GO i le proteome. O aū e fa'atusalia ai avetaavale o le transcript ma le porotini ma o latou fa'atonuga. E, F. Ata o le Uniform manifold approximation and projection (UMAP) o fa'aupuga o foliga talafeagai fa'aklinikal e fa'aalia ai le fa'aalia o le gradients e tuto'atasi mai le ituaiga alava lemu/vave. G, H. Feso'ota'iga i le va o avetaavale o le PC2 ma le PC1 i transcriptomes ma proteomes.
E le'i mafaufauina, o le ituaiga myofiber e fa'avae i luga o le MYH na fa'amatalaina na'o le tikeri lona lua maualuga o le fesuia'iga (PC2), ma fa'ailoa mai ai o isi mea fa'aletino e le feso'ota'i ma le ituaiga myofiber e fa'avae i luga o le MYH (PC1) e iai se sao taua i le fa'atonutonuina o le eseesega o alava o maso skeletal. O le su'esu'ega o le tele o fa'amatalaga o mea e sili ona taua i le PC1 na fa'aalia ai o le fesuia'iga i le PC1 na mafua ona o le pipii o le sela-sela ma le anotusi o le ribosome i le transcriptome, ma costameres ma porotini ribosomal i le proteome (Ata 2B ma Ata Fa'aopoopo 6D–E, Seti Fa'amatalaga Fa'aopoopo 7). I maso skeletal, e fa'afeso'ota'i e costameres le Z-disc i le sarcolemma ma e a'afia i le fesiita'iga o le malosi ma le fa'ailoilo. 25 Fa'ailoga PCA fa'amaonia e fa'aaoga ai le pipii o le sela-sela (transcriptome, Ata 2C) ma foliga o le costamere (proteome, Ata 2D) na fa'aalia ai se suiga malosi i le agavale i le PC1, e fa'ailoa mai ai o nei foliga e fa'amauoa i nisi alava.
O se suʻesuʻega auiliili o le faʻaputuga o le myofiber i le tulaga UMAP na faʻaalia ai o le tele o foliga na faʻaalia ai le gradient o le faʻaalia o le myofiber type-independent MYH nai lo le myofiber subcluster-specific. O lenei faʻaauauga na matauina mo le tele o genes e fesoʻotaʻi ma tulaga faʻamaʻi (Ata 2E), e pei o le CHCHD10 (faʻamaʻi neuromuscular), SLIT3 (atrophy muscle), CTDNEP1 (faʻamaʻi muscle). O lenei faʻaauauga na matauina foi i le proteome, e aofia ai porotini e fesoʻotaʻi ma faʻaletonu o le neura (UGDH), insulin signaling (PHIP), ma le transcription (HIST1H2AB) (Ata 2F). I le tuʻufaʻatasia, o nei faʻamaumauga e faʻaalia ai le faʻaauauga i le heterogeneity o le fiber type-independent slow/fast twitch i myofibers eseese.
O le mea e malie ai, o genes o avetaavale i le PC2 na faaalia ai le lelei o le fesootaiga o le transcriptome-proteome (r = 0.663) (Ata 2G), o loʻo faʻaalia ai o ituaiga o alava e lemu ma vave ona mimilo, aemaise lava o meatotino faʻamalosi ma le metabolism o alava o maso skeletal, e faʻatonutonuina e le tusitusiga. Peitaʻi, o genes o avetaavale i le PC1 e leai se fesootaiga o le transcriptome-proteome (r = -0.027) (Ata 2H), o loʻo faʻaalia ai o suiga e le fesoʻotaʻi ma ituaiga o alava e lemu/vave ona mimilo e tele lava ina faʻatonutonuina pe a uma le tusitusiga. Talu ai o suiga i le PC1 na faʻamatalaina muamua lava e ala i upu ontology o gene ribosomal, ma ona o ribosomes e iai se matafaioi taua ma faʻapitoa i le sela e ala i le auai malosi ma le faʻaosofiaina o le faʻaliliuga o porotini,31 na matou faia ai loa le suʻesuʻega o lenei eseesega e leʻi mafaufauina o ribosomal.
Na matou valiina muamua le ata o le auiliiliga o vaega autū o le proteomics e tusa ai ma le tele o porotini i le faaupuga GOCC "cytoplasmic ribosome" (Ata 3A). E ui o lenei faaupuga e faʻamauoa i le itu lelei o le PC1, ma iʻu ai i se gradient laʻititi, o porotini ribosomal e faʻatautaia ai le vaeluaina i itu uma e lua o le PC1 (Ata 3A). O porotini ribosomal e faʻamauoa i le itu leaga o le PC1 e aofia ai le RPL18, RPS18, ma le RPS13 (Ata 3B), ae o le RPL31, RPL35, ma le RPL38 (Ata 3C) o mea autu ia e faʻatautaia ai le itu lelei o le PC1. O le mea e malie ai, o le RPL38 ma le RPS13 sa maualuga lona faʻaalia i maso skeletal pe a faʻatusatusa i isi aano (Ata Faʻaopoopo 7A). O nei faʻailoga ribosomal tulaga ese i le PC1 e leʻi vaʻaia i le transcriptome (Ata Faʻaopoopo 7B), e faʻaalia ai le faʻatonutonuina o le maeʻa ai o le tusitusiga.
A. O le ata o le auiliiliga o vaega autū (PCA) ua valiina e tusa ai ma le cytoplasmic ribosomal gene ontology (GO) i luga o le proteome. O aū e faʻaalia ai le itu o le suiga e mafua mai i porotini i le ata PCA. O le umi o le laina e fetaui ma le togi o vaega autū mo se porotini ua tuʻuina atu. B, C. O ata o foliga PCA mo le RPS13 ma le RPL38. D. Auʻiliʻiliga faʻaputuga faʻasolosolo e leʻi vaʻavaʻaia o porotini ribosomal cytoplasmic. E. Faʻataʻitaʻiga faʻatulagaina o le 80S ribosome (PDB: 4V6X) o loʻo faʻamamafaina ai porotini ribosomal ma le tele eseese i alava maso skeletal. F. Porotini ribosomal ma le stoichiometry eseese o loʻo i tafatafa o le auala e alu ese ai le mRNA.
Ua uma ona fautuaina muamua manatu o le heterogeneity ma le specialization o ribosomal, lea e mafai ai e le i ai o ni vaega eseese o ribosome (ribosomal heterogeneity) ona aafia sa'o ai le faaliliuga o porotini i aano eseese32 ma sela33 e ala i le faaliliuga filifilia o ni vaega faapitoa o le transcript mRNA34 (ribosome specialization). Ina ia iloa vaega laiti o porotini ribosomal o lo'o fa'aalia fa'atasi i alava o maso skeletal, na matou faia ai se su'esu'ega fa'aputuga fa'asolosolo e le'i va'ava'aia o porotini ribosomal i le proteome (Ata 3D, Seti Fa'amatalaga Fa'aopoopo 8). E pei ona fa'amoemoeina, o porotini ribosomal e le'i fa'aputuina e ala i le ituaiga alava e fa'avae i luga o le MYH. Peita'i, na matou fa'ailoaina ni vaega eseese se tolu o porotini ribosomal; o le vaega muamua (ribosomal_cluster_1) e fa'atasi ma le RPL38 ma o lea ua fa'ateleina ai le fa'aalia i alava ma se fa'amatalaga lelei o le PC1. O le vaega lona lua (ribosomal_cluster_2) e fa'atasi ma le RPS13 ma ua si'itia i alava ma se fa'amatalaga leaga o le PC1. O le vaega lona tolu (ribosomal_cluster_3) e le o faʻaalia ai le faʻaalia eseese faʻatasi i totonu o alava maso skeletal ma e mafai ona manatu o le porotini ribosomal "autu" o maso skeletal. O vaega uma e lua o le ribosomal 1 ma le 2 o loʻo i ai porotini ribosomal ua uma ona faʻaalia muamua e faʻatonutonu ai le faʻaliliuga eseese (e pei o le RPL10A, RPL38, RPS19, ma le RPS25) ma faʻaosofia ai le atinaʻe (e pei o le RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 E ogatasi ma taunuuga o le PCA, o le faʻatusa eseese na matauina o nei porotini ribosomal i luga o alava na faʻaalia ai foi le faʻaauauina (Ata Faʻaopoopo 7C).
Ina ia vaʻaia le tulaga o porotini ribosomal eseese i totonu o le ribosome, na matou faʻaaogaina se faʻataʻitaʻiga faʻatulagaina o le ribosome 80S a le tagata (Protein Data Bank: 4V6X) (Ata 3E). Ina ua maeʻa ona vavaeʻeseina porotini ribosomal e aofia i vaega eseese o ribosomal, e leʻi tutusa lelei o latou nofoaga, ma faʻaalia ai e leʻi mafai e la matou auala ona faʻaleleia atili nisi vaega/vaega o le ribosome. Peitaʻi, o le mea e malie ai, o le vaega o porotini tetele i le vaega 2 e maualalo ifo nai lo vaega 1 ma le 3 (Ata Faʻaopoopo 7D). Na matou matauina o porotini ma le stoichiometry ua suia i totonu o alava o maso skeletal na tele lava ina faʻatulagaina i luga o le ribosome (Ata 3E), e ogatasi ma lo latou gafatia e fegalegaleai ma elemene o le nofoaga ulufale o le ribosome i totonu (IRES) i totonu o vaega eseese o le mRNA, ma faʻamaopoopo ai le faʻaliliuga filifilia. 40, 41 E le gata i lea, o le tele o porotini ma le stoichiometry ua suia i totonu o alava o maso skeletal na i ai i tafatafa o vaega faʻatino e pei o le alavai e alu ese ai le mRNA (Ata 3F), lea e faʻatonutonuina ai le faʻalauteleina o le faʻaliliuga ma le taofia o peptides faʻapitoa. 42 I se aotelega, o a matou faʻamaumauga e faʻaalia ai o le stoichiometry o porotini ribosomal o maso skeletal e faaalia ai le eseese, ma mafua ai ona i ai eseesega i le va o alava o maso skeletal.
Na matou amata loa ona fa'ailoa mai fa'ailoga o alava e vave ma le lemu ona mimilo ma su'esu'e auala e fa'atonutonu ai a latou tusitusiga. I le fa'atusatusaina o fa'aputuga alava e vave ma le lemu ona mimilo ua fa'amatalaina e le UMAP i fa'amaumauga e lua (Ata 1G–H ma le 4A–B), o su'esu'ega o le transcriptomic ma le proteomic na fa'ailoa mai ai foliga eseese e 1366 ma le 804, i le fa'asologa (Ata 4A–B, Seti Fa'aopoopo 9–12). Na matou matauina eseesega fa'amoemoeina i fa'ailoga e feso'ota'i ma sarcomeres (e.g., tropomyosin ma troponin), excitation-contraction coupling (SERCA isoforms), ma le metabolism o le malosi (e.g., ALDOA ma CKB). E le gata i lea, o tusitusiga ma porotini e fa'atonutonuina le ubiquitination o porotini na fa'aalia eseese i alava e vave ma le lemu ona mimilo (e.g., USP54, SH3RF2, USP28, ma USP48) (Ata 4A–B). E le gata i lea, o le microbial protein gene RP11-451G4.2 (DWORF), lea na faʻaalia muamua e eseese lona faʻaalia i ituaiga alava o maso mamoe43 ma faʻaleleia atili ai le gaioiga a le SERCA i maso o le fatu44, na matua faʻateleina i alava o maso skeletal e lemu (Ata 4A). I ​​se tulaga tutusa, i le tulaga o alava taʻitasi, na matauina ai eseesega taua i faʻailoga ua iloa e pei o le metabolism-related lactate dehydrogenase isoforms (LDHA ma LDHB, Ata 4C ma le Ata Faʻaopoopo 8A)45,46 faʻapea foʻi ma faʻailoga faʻapitoa o ituaiga alava e leʻi iloa muamua (e pei o le IRX3, USP54, USP28, ma le DPYSL3) (Ata 4C). Sa i ai se fefiloi taua o foliga eseese o loʻo faʻaalia i le va o faʻamaumauga o le transcriptomic ma le proteomic (Ata Faʻaopoopo 8B), faʻapea foʻi ma se fesoʻotaʻiga o suiga o le gaugau na mafua ona o le faʻaalia eseese o foliga o sarcomere (Ata Faʻaopoopo 8C). E tāua tele, o nisi o saini (e pei o le USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) na faʻaalia ai le malosi o le faʻatonutonuina o le faʻaliliuga i le tulaga proteomic ma sa i ai ni faʻamatalaga faʻapitoa o le faʻaalia o le ituaiga o alava twitch (Ata Faʻaopoopo 8C).
O ata o mauga mu A ma le B o loʻo faʻatusatusa ai vaega e lemu ma vave na faʻailoa mai e ala i ata o le uniform manifold approximation and projection (UMAP) i Ata 1G–H. O togitogi lanu e faʻatusalia ai tusitusiga poʻo porotini e matua eseese lava i le FDR < 0.05, ma o togitogi pogisa e faʻatusalia ai tusitusiga poʻo porotini e matua eseese lava i le suiga o le log > 1. O le auʻiliʻiliga faʻamaumauga e lua-ala na faia e faʻaaoga ai le suʻega DESeq2 Wald ma le Benjamini–Hochberg adjusted p values ​​​​(transcriptomics) poʻo le metotia o le Limma linear model ma le empirical Bayesian analysis sosoo ai ma le Benjamini–Hochberg adjustment mo le tele o faʻatusatusaga (proteomics). C Signature plots o genes poʻo porotini ua filifilia eseese le faʻaalia i le va o alava lemu ma vave. D Enrichment analysis o tusitusiga ma porotini e matua eseese le faʻaalia. O tau faʻapipiʻi e faʻamauoa i faʻamaumauga uma e lua, o tau o transcriptome e faʻamauoa naʻo le transcriptome, ma o tau o proteome e faʻamauoa naʻo le proteome. O le auʻiliʻiliga faʻamaumauga na faia e faʻaaoga ai le afifi clusterProfiler ma le Benjamini-Hochberg adjusted p-values. E. Fa'ailoga fa'apitoa o le fa'aliliuga o ituaiga alava ua fa'ailoa mai e le SCENIC e fa'avae i luga o togi fa'apitoa o le fa'atonutonu e maua mai i le SCENIC ma le eseesega o le fa'aalia o le mRNA i le va o ituaiga alava. F. Fa'avasegaina o fa'ailoga fa'aliliuga ua filifilia ua eseese le fa'aalia i le va o alava gese ma vave.
Ona matou faia lea o se suʻesuʻega o le soona fai o kene ma porotini ua faʻatusalia eseese (Ata 4D, Seti Faʻamatalaga Faʻaopoopo 13). O le faʻaleleia atili o auala mo foliga na eseese i le va o faʻamaumauga e lua na faʻaalia ai eseesega na faʻamoemoeina, e pei o le fatty acid β-oxidation ma le ketone metabolism processes (fibres gesegese), myofilament/muscle contraction (fibres vave ma gesegese, i le faasologa), ma le carbohydrate catabolic processes (fibres vave). O le serine/threonine protein phosphatase activity na siʻitia foʻi i fibres vave, e mafua mai i foliga e pei o le regulatory ma le catalytic phosphatase subunits (PPP3CB, PPP1R3D, ma le PPP1R3A), ia ua iloa e faʻatonutonu le glycogen metabolism (47) (Ata Faʻaopoopo 8D–E). O isi auala na fa'amauoa i alava vave e aofia ai le fa'agasologa (P-) tino (YTHDF3, TRIM21, LSM2) i le proteome (Ata Fa'aopoopo 8F), atonu e a'afia i le fa'atonutonuina o le fa'aliliuga pe a uma le tusitusiga (48), ma le gaioiga o le transcription factor (SREBF1, RXRG, RORA) i le transcriptome (Ata Fa'aopoopo 8G). O alava lemu na fa'amauoa i le gaioiga o le oxidoreductase (BDH1, DCXR, TXN2) (Ata Fa'aopoopo 8H), fusifusia o le amide (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Ata Fa'aopoopo 8I), matrix extracellular (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Ata Fa'aopoopo 8J), ma le gaioiga o le receptor-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (Ata Fa'aopoopo 8K).
Ina ia maua se malamalamaga atili i le faʻatonutonuina o le faʻaliliuga o loʻo i lalo o uiga o le ituaiga o alava maso e lemu/vave, na matou faia ai le suʻesuʻega o le faʻamalosia o le transcription factor e faʻaaoga ai le SCENIC49 (Seti Faʻamatalaga Faʻaopoopo 14). O le tele o transcription factors na matua faʻamauoa i le va o alava maso vave ma le lemu (Ata 4E). E aofia ai transcription factors e pei o le MAFA, lea na muamua fesoʻotaʻi ma le atinaʻeina vave o alava maso,50 faʻapea foʻi ma le tele o transcription factors e leʻi fesoʻotaʻi muamua ma polokalame gene faʻapitoa o ituaiga alava maso. I totonu o nei mea, o le PITX1, EGR1, ma le MYF6 o transcription factors sili ona faʻamauoa i alava maso vave (Ata 4E). I se faʻatusatusaga, o le ZSCAN30 ma le EPAS1 (e taʻua foʻi o HIF2A) o transcription factors sili ona faʻamauoa i alava maso lemu (Ata 4E). E ogatasi ma lenei mea, o le MAFA na faʻaalia i tulaga maualuga i le itulagi UMAP e fetaui ma alava maso vave, ae o le EPAS1 sa i ai le mamanu faʻaalia faʻafeagai (Ata 4F).
I le fa’aopoopoga i kene ua iloa e fa’ailoa ai porotini, e tele fo’i ituaiga RNA e le fa’ailoaina ai ni fa’ailoga e ono a’afia i le fa’atonutonuina o le atina’eina o tagata ma fa’ama’i. 51, 52 I fa’amaumauga o le transcriptome, o le tele o RNA e le fa’ailoaina ai ni fa’ailoga e fa’aalia ai le fa’apitoa o ituaiga alava (Ata 5A ma le Seti Fa’aopoopo 15), e aofia ai le LINC01405, lea e matua fa’apitoa lava mo alava e lemu ma ua lipotia mai ua fa’aitiitia i maso mai gasegase e maua i le mitochondrial myopathy. 53 I se fa’atusatusaga, o le RP11-255P5.3, e tutusa ma le kene lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, e fa’aalia ai le fa’apitoa o ituaiga alava vave. O LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) ma le RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) e faʻaalia ai le faʻapitoa o maso skeletal (Ata Faʻaopoopo 9A–B) ma e leai ni genes contractile ua iloa i totonu o latou genomic neighborhood 1 Mb, ma faʻaalia ai o loʻo i ai la latou matafaioi faʻapitoa i le faʻatonutonuina o ituaiga fiber nai lo le faʻatonutonuina o genes contractile tuaoi. O faʻamatalaga faʻapitoa o le faʻaalia o le ituaiga fiber e lemu/vave o le LINC01405 ma le RP11-255P5.3, i le faʻasologa, na faʻamaonia e faʻaaoga ai le RNAscope (Ata 5B–C).
A. O tusitusiga RNA e le o ni fa'ailoga e fa'atonutonuina tele i alava maso e vave ma le gatete. B. Ata fa'atusa o le RNAscope o lo'o fa'aalia ai le fa'apitoa o le ituaiga alava e vave ma le gatete o le LINC01405 ma le RP11-255P5.3, i le fa'asologa. Pa fua = 50 μm. C. Fuainumera o le fa'aalia o le RNA e le o ni fa'ailoga e fa'apitoa i le ituaiga myofiber e pei ona fuafuaina e le RNAscope (n = 3 biopsies mai tagata tuto'atasi, fa'atusatusa alava maso vave ma le gatete i totonu o tagata ta'ito'atasi). Sa faia le au'ili'iliga fa'amaumauga e fa'aaoga ai le suega t-lua a le Student. O ata o pusa e fa'aalia ai le ogatotonu ma le kuata muamua ma le tolu, fa'atasi ai ma ūsi e fa'asino i tau maualalo ma maualuga. D. Faiga o le fa'ailoaina o le porotini microbial de novo (na fatuina ma BioRender.com). E. O le porotini microbial LINC01405_ORF408:17441:17358 e fa'aalia fa'apitoa i alava maso skeletal e lemu (n=5 biopsies mai tagata auai tuto'atasi, fa'atusatusa alava maso vave ma le gatete i tagata auai ta'itasi). Sa faia le au'ili'iliga fa'amaumauga e fa'aaoga ai le metotia o le fa'ata'ita'iga laina Limm fa'atasi ai ma se auala fa'atino a Bayesian, sosoo ai ma le metotia a Benjamini-Hochberg mo fa'atusatusaga eseese ma le fetu'una'iga o le p-value. O ata o pusa e fa'aalia ai le ogatotonu, kuata muamua ma le tolu, fa'atasi ai ma whispers o lo'o fa'asino i tau maualuga/maualalo.
Talu ai nei, ua faʻaalia e suʻesuʻega o le tele o tusitusiga e le o ni faʻailoga e faʻailoa ai ni porotini microbial ua faʻaliliuina, o nisi o ia mea e faʻatonutonuina ai le galuega a maso. 44, 55 Ina ia iloa ai porotini microbial e iai le ituaiga fiber specificity, na matou suʻeina la matou faʻamaumauga o le 1000 fiber proteome e faʻaaoga ai se faila FASTA faʻapitoa o loʻo iai faʻasologa o tusitusiga e le o ni faʻailoga (n = 305) o loʻo maua i le faʻamaumauga o le 1000 fiber transcriptome (Ata 5D). Na matou faʻailoaina ni porotini microbial e 197 mai tusitusiga eseese e 22, e 71 o ia mea na faʻatonutonuina eseese i le va o alava maso skeletal e lemu ma vave (Ata Faʻaopoopo 9C ma le Seti Faʻamatalaga Faʻaopoopo 16). Mo LINC01405, e tolu oloa porotini microbial na faʻailoaina, o le tasi o ia mea na faʻaalia ai le tutusa o le fiber specificity i lana tusitusiga (Ata 5E ma le Ata Faʻaopoopo 9D). O lea la, na matou faʻailoaina ai LINC01405 o se gene e faʻailoa ai se porotini microbial e faʻapitoa mo alava maso skeletal e lemu.
Na matou atiaeina se faiga faigaluega atoatoa mo le faʻamatalaina tele o le proteomic o alava maso taʻitasi ma faʻailoa mai ai faʻatonutonu o le heterogeneity o alava i tulaga maloloina. Na matou faʻaaogaina lenei faiga faigaluega e malamalama ai pe faʻapefea ona aʻafia e nemaline myopathies le heterogeneity o alava maso skeletal. O nemaline myopathies o faʻamaʻi maso e tuʻufaʻasolo mai e mafua ai le vaivai o maso ma, i tamaiti ua aʻafia, e iai le tele o faʻalavelave e aofia ai le faigata o le manava, scoliosis, ma le faʻatapulaʻaina o le gaioiga o vae. 19,20 E masani lava, i nemaline myopathies, o suiga faʻamaʻi i genes e pei o le actin alpha 1 (ACTA1) e mafua ai le tele o le faʻasologa o le myofiber fiber e lemu lemu, e ui o lenei aafiaga e eseese. O se tasi o tuusaunoaga mataʻina o le troponin T1 nemaline myopathy (TNNT1), lea e tele ai alava vave. O le mea lea, o se malamalamaga sili atu i le heterogeneity o loʻo i lalo o le faʻaletonu o alava maso skeletal e matauina i nemaline myopathies e mafai ona fesoasoani e faʻamatalaina le sootaga faigata i le va o nei faʻamaʻi ma le ituaiga myofiber.
Pe a faatusatusa i pulega maloloina (n=3 i le vaega), o myofibers na vavaeese mai gasegase nemaline myopathy ma fesuiaiga i le ACTA1 ma le TNNT1 genes na faaalia ai le myofiber atrophy po o le dystrophy (Ata 6A, Supplementary Table 3). O lenei mea na aumaia ai ni luitau faatekinolosi taua mo le auiliiliga o proteomic ona o le tapulaa o mea o loo maua. E ui i lea, na mafai ona matou iloa 2485 porotini i le 272 skeletal myofibers. Ina ua maeʻa ona faamama mo le itiiti ifo i le 1000 porotini ua fuaina i le fiber, na faia ai le 250 fibers i le auiliiliga o bioinformatics mulimuli ane. Ina ua maeʻa ona faamama, na fuaina le averesi o le 1573 ± 359 porotini i le fiber (Supplementary Figure 10A, Supplementary Data Sets 17–18). E taua tele, e ui i le faaitiitia tele o le tele o le fiber, ae na o sina faaitiitia lava le loloto o le proteome o faataitaiga o gasegase nemaline myopathy. E le gata i lea, o le fa'agasologaina o nei fa'amaumauga e fa'aaoga ai a matou lava faila FASTA (e aofia ai tusitusiga e le o ni fa'ailoga) na mafai ai ona matou fa'ailoa mai ni polotini siama e lima i totonu o myofibers skeletal mai gasegase nemaline myopathy (Seti Fa'amatalaga Fa'aopoopo 19). O le lautele o le dynamic range o le proteome sa matua lautele lava, ma o polotini uma i le vaega pulea sa feso'ota'i lelei ma taunu'uga o se su'esu'ega muamua o le 1000-fiber proteome (Ata Fa'aopoopo 10B–C).
A. Ata fa'amikroskopi o lo'o fa'aalia ai le pala po'o le fa'aleagaina o le alava ma le tele o ituaiga alava eseese e fa'atatau i le MYH i le ACTA1 ma le TNNT1 nemaline myopathies (NM). Pa fua = 100 μm. Ina ia mautinoa le toe gaosia o le valivali i gasegase ACTA1 ma le TNNT1, e tolu biopsies o gasegase na valivali fa'alua i le fa'atolu (vaega e fa i le mataupu) a'o le'i filifilia ni ata fa'atusa. B. Fua fa'atatau o ituaiga alava i tagata auai e fa'atatau i le MYH. C. Ata o le auiliiliga o vaega autu (PCA) o alava maso skeletal i gasegase e iai nemaline myopathies ma tagata e pulea. D. Alava maso skeletal mai gasegase e iai nemaline myopathies ma tagata e pulea ua fa'aalia i luga o se ata PCA ua fuafuaina mai le 1000 alava na su'esu'eina i le Ata 2. Mo se fa'ata'ita'iga, ata o mauga mu e fa'atusatusa ai eseesega i le va o tagata auai ma ACTA1 ma TNNT1 nemaline myopathies ma tagata e pulea, ma le va o tagata auai ma ACTA1 ma TNNT1 nemaline myopathies. O li'o lanu e fa'ailoa mai ai porotini na matua'i eseese i le π < 0.05, ma o togitogi pogisa e fa'ailoa mai ai porotini na matua'i eseese i le FDR < 0.05. Sa faia le au'ili'iliga fa'amaumauga e fa'aaoga ai le metotia o le fa'ata'ita'iga laina Limma ma metotia Bayesian fa'apitoa, sosoo ai ma le fetu'una'iga o le p-value mo fa'atusatusaga eseese e fa'aaoga ai le metotia a Benjamini-Hochberg. H. Au'ili'iliga fa'amauoa o porotini na matua'i eseese le fa'aalia i le proteome atoa ma i alava ituaiga 1 ma le 2A. Sa faia le au'ili'iliga fa'amaumauga e fa'aaoga ai le afifi clusterProfiler ma Benjamini-Hochberg na fetu'una'i p-values. I, J. Principal component analysis (PCA) plots na valiina e le extracellular matrix ma mitochondrial gene ontology (GO) terms.
Ona o nemaline myopathies e mafai ona aʻafia ai le vaega o ituaiga myofiber e faʻaalia ai le MYH i maso skeletal,19,20 na matou suʻesuʻeina muamua ituaiga myofiber e faʻaalia ai le MYH i gasegase e iai nemaline myopathies ma tagata e pulea. Na matou fuafuaina le ituaiga myofiber e faʻaaoga ai se metotia e le faʻaituau na faʻamatalaina muamua mo le 1000 myofiber assay (Supplementary Figs. 10D–E) ma toe le mafai ona faʻailoa mai mama 2X myofibers (Ata 6B). Na matou matauina se aafiaga eseese o nemaline myopathies i le ituaiga myofiber, aua e toʻalua gasegase e iai suiga o le ACTA1 na faʻateleina le vaega o le ituaiga 1 myofibers, ae o le toʻalua gasegase e iai le TNNT1 nemaline myopathy na faʻaitiitia le vaega o le ituaiga 1 myofibers (Ata 6B). E moni, o le fa'aalia o le MYH2 ma le fast troponin isoforms (TNNC2, TNNI2, ma le TNNT3) na fa'aitiitia i le ACTA1-nemaline myopathies, ae o le fa'aalia o le MYH7 na fa'aitiitia i le TNNT1-nemaline myopathies (Fa'aopoopoga Ata 11A). E ogatasi lea ma lipoti muamua o le heterogeneous myofiber type switching i nemaline myopathies.19,20 Na matou fa'amaonia nei taunuuga e ala i le immunohistochemistry ma maua ai o gasegase e iai le ACTA1-nemaline myopathy e sili atu le tele o le type 1 myofibers, ae o gasegase e iai le TNNT1-nemaline myopathy e iai le mamanu fa'afeagai (Ata 6A).
I le tulaga o le proteome e tasi le alava, o alava maso o le skeletal mai gasegase e maua i le ACTA1 ma le TNNT1 nemaline myopathy na fa'apotopoto fa'atasi ma le tele o alava fa'atonutonu, ma o alava TNNT1 nemaline myopathy e masani ona sili ona a'afia (Ata 6C). Sa matua manino lava lenei mea pe a fa'atulagaina ni ata o le au'ili'iliga o vaega autu (PCA) o alava pseudo-inflated mo gasegase ta'itasi, fa'atasi ai ma gasegase TNNT1 nemaline myopathy 2 ma le 3 na foliga mai e sili ona mamao mai fa'ata'ita'iga fa'atonutonu (Ata Fa'aopoopo 11B, Seti Fa'amatalaga Fa'aopoopo 20). Ina ia malamalama atili i le fa'atusatusaga o alava mai gasegase e maua i le myopathy ma alava maloloina, na matou fa'aaogaina fa'amatalaga auiliili na maua mai le au'ili'iliga proteomic o alava e 1,000 mai tagata matutua maloloina. Na matou fa'aalia alava mai le fa'amaumauga o le myopathy (ma'i ACTA1 ma le TNNT1 nemaline myopathy ma tagata fa'atonutonu) i luga o le ata PCA na maua mai le au'ili'iliga proteomic 1000-fiber (Ata 6D). O le tufatufaina o ituaiga alava MYH i luga o le PC2 i alava fa'atonutonu sa tutusa ma le tufatufaina o alava na maua mai le au'ili'iliga proteomic 1000-alava. Peita'i, o le tele o alava i gasegase nemaline myopathy na siitia ifo i lalo i le PC2, ma fe'avea'i ma alava maloloina vave-twitch, e tusa lava po'o le a le ituaiga alava MYH moni. O lea la, e ui lava ina fa'aalia e gasegase e iai le ACTA1 nemaline myopathy se suiga agai i alava ituaiga 1 pe a fuaina e fa'aaoga ai metotia fa'avae i le MYH, o le ACTA1 nemaline myopathy ma le TNNT1 nemaline myopathy na siitia le alava proteome o maso skeletal agai i alava vave-twitch.
Ona matou faʻatusatusa saʻo lea o vaega taʻitasi o gasegase ma tagata e maloloina ma faʻailoa mai ai porotini eseese e 256 ma le 552 i le ACTA1 ma le TNNT1 nemaline myopathies, i le faasologa lava lea (Ata 6E–G ma le Ata Faʻaopoopo 11C, Seti Faʻamatalaga Faʻaopoopo 21). O le auʻiliʻiliga o le faʻamalosia o kene na faʻaalia ai se faʻaitiitia faʻatasi o porotini mitochondrial (Ata 6H–I, Seti Faʻamatalaga Faʻaopoopo 22). O le mea e ofo ai, e ui lava i le eseesega o le tele o ituaiga fiber i le ACTA1 ma le TNNT1 nemaline myopathies, o lenei faʻaitiitia e matua tutoʻatasi lava mai le ituaiga fiber e faʻavae i le MYH (Ata 6H ma Ata Faʻaopoopo 11D–I, Seti Faʻamatalaga Faʻaopoopo 23). E tolu porotini microbial na faʻatonutonuina foʻi i le ACTA1 poʻo le TNNT1 nemaline myopathies. E lua o nei microproteins, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (e taʻua foʻi o LINC00598 poʻo Lnc-FOXO1) ma le ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), na faʻaalia ai le tele o le eseesega i totonu o le ituaiga 1 myofibers. Na lipotia muamua le ENSG00000215483_TR14_ORF67 e iai sona sao i le faʻatonutonuina o le taʻamilosaga o le sela. 56 I le isi itu, o le ENSG00000232046_TR1_ORF437 (e tutusa ma le LINC01798) na faʻateleina i le ituaiga 1 ma le ituaiga 2A myofibers i le ACTA1-nemaline myopathy pe a faʻatusatusa i tagata soifua maloloina (Faʻaopoopoga Ata 12A, Faʻaopoopoga Seti Faʻamatalaga 24). I se faatusatusaga, o polotini ribosomal e leʻi tele se aafiaga i le nemaline myopathy, e ui lava ina sa faaitiitia le RPS17 i ​​le ACTA1 nemaline myopathy (Ata 6E).
O le au'ili'iliga fa'amauoa na fa'aalia ai fo'i le fa'ateleina o faiga o le puipuiga o le tino i le ACTA1 ma le TNNT1 nemaline myopathy, a'o fa'ateleina fo'i le pipi'i o sela i le TNNT1 nemaline myopathy (Ata 6H). O le fa'amauoa o nei mea i fafo atu o le tino na atagia mai e polotini o le matrix i fafo atu o le tino o lo'o suia le PCA i le PC1 ma le PC2 i se itu leaga (e pei o, agai atu i alava e sili ona a'afia) (Ata 6J). O vaega uma e lua o gasegase na fa'aalia ai le fa'ateleina o le fa'aalia o polotini i fafo atu o le tino e a'afia i tali atu o le puipuiga o le tino ma faiga fa'aleleia o le sarcolemmal, e pei o annexins (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 ma a latou polotini fegalegaleai S100A1159 (Ata Fa'aopoopo 12B–C). O lenei faiga na lipotia muamua o lo'o fa'aleleia atili i muscular dystrophies60 ae, i lo matou iloa, e le'i feso'ota'i muamua ma nemaline myopathies. O le galuega masani a lenei masini molecular e mana'omia mo le toe fa'aleleia o le sarcolemmal pe a uma le manu'a ma mo le tu'ufa'atasia o myocytes fou fa'ato'a fausia ma myofibers58,61. O le mea lea, o le faʻateleina o le gaioiga o lenei faiga i vaega uma e lua o gasegase ua fautua mai ai se tali faʻaleleia i manuʻa e mafua mai i le le mautu o le myofiber.
Sa feso'ota'i lelei aafiaga o nemaline myopathy ta'itasi (r = 0.736) ma fa'aalia ai le tutusa lelei (Ata Fa'aopoopo 11A–B), o lo'o fa'ailoa mai ai o le ACTA1 ma le TNNT1 nemaline myopathy e tutusa aafiaga i le proteome. Peita'i, o nisi porotini sa fa'atonutonuina na'o le ACTA1 po'o le TNNT1 nemaline myopathy (Ata Fa'aopoopo 11A ma le C). O le porotini profibrotic MFAP4 o se tasi o porotini sili ona fa'aleleia i le TNNT1 nemaline myopathy ae sa tumau pea le le suia i le ACTA1 nemaline myopathy. O le SKIC8, o se vaega o le PAF1C complex e nafa ma le fa'atonutonuina o le HOX gene transcription, sa fa'aitiitia i le TNNT1 nemaline myopathy ae le'i a'afia i le ACTA1 nemaline myopathy (Ata Fa'aopoopo 11A). O le fa'atusatusaga tuusa'o o le ACTA1 ma le TNNT1 nemaline myopathy na fa'aalia ai le fa'aitiitia tele o polotini mitochondrial ma le fa'ateleina o polotini o le puipuiga o le tino i le TNNT1 nemaline myopathy (Ata 6G–H ma Ata Fa'aopoopo 11C ma le 11H–I). O nei fa'amaumauga e ogatusa ma le tele o le atrophy/dystrophy na matauina i le TNNT1 nemaline myopathy pe a fa'atusatusa i le TNNT1 nemaline myopathy (Ata 6A), ma fa'ailoa mai ai o le TNNT1 nemaline myopathy o lo'o fa'atusalia ai se ituaiga sili atu ona ogaoga o le fa'ama'i.
Ina ia iloilo pe o tumau pea aafiaga o le nemaline myopathy i le tulaga atoa o maso, na matou faia ai se auiliiliga tele o le proteomic o biopsies o maso mai le vaega lava e tasi o gasegase TNNT1 nemaline myopathy ma faatusatusa i latou ma vaega pulea (n=3 i le vaega) (Ata Faaopoopo 13A, Seti Faaopoopo o Faamatalaga 25). E pei ona faamoemoeina, o vaega pulea sa fesoʻotaʻi vavalalata i le auiliiliga o vaega autu, ae o gasegase TNNT1 nemaline myopathy na faaalia ai le eseesega maualuga i le va o faataitaiga e tutusa ma le mea na vaaia i le auiliiliga o le alava e tasi (Ata Faaopoopo 13B). O le auiliiliga tele na toe gaosia ai porotini eseese o loʻo faʻaalia (Ata Faaopoopo 13C, Seti Faaopoopo o Faamatalaga 26) ma faiga faʻaola (Ata Faaopoopo 13D, Seti Faaopoopo o Faamatalaga 27) na faʻamamafaina e ala i le faatusatusaina o alava taʻitasi, ae na leiloa le mafai ona iloa le eseesega i le va o ituaiga alava eseese ma le mafai ona faʻamatalaina aafiaga eseese o faʻamaʻi i alava.
A tuufaatasia, o nei faamaumauga ua faaalia ai e mafai e le single-myofiber proteomics ona faamanino mai foliga vaaia o mea tau soifua maloloina e le mafai ona iloa e ala i metotia faapitoa e pei o le immunoblotting. E le gata i lea, o nei faamaumauga ua faamamafaina ai tapula’a o le faaaogaina na o le actin fiber typing (MYH) e faamatala ai le fetuunaiga o le phenotypic. E moni, e ui lava e eseese le fesuia’iga o le fiber type i le va o le actin ma le troponin nemaline myopathies, ae o nemaline myopathies uma e lua e vavaeeseina le MYH fiber typing mai le metabolism o le skeletal muscle fiber agai atu i se muscle proteome e vave ma itiiti ifo le oxidative.
E taua tele le eseesega o sela mo aano o manuʻa ina ia faʻafetaui ai manaʻoga eseese. I maso o le tino, e masani ona faʻamatalaina lenei mea o ituaiga alava e faʻailoaina i tikeri eseese o le gaosiga o le malosi ma le vaivai. Peitaʻi, e manino lava o lenei mea e naʻo se vaega itiiti lava o le eseesega o alava o maso o le tino e faʻamatalaina ai, lea e sili atu ona fesuisuiaʻi, lavelave ma tele ona itu nai lo le mea na mafaufauina muamua. Ua faʻamalamalamaina nei e alualu i luma faʻatekonolosi mea e faʻatonutonuina ai alava o maso o le tino. O le mea moni, o a matou faʻamaumauga e fautua mai ai atonu e le o se ituaiga alava eseese o maso o le tino le alava ituaiga 2X. E le gata i lea, na matou faʻailoaina porotini metabolic, porotini ribosomal ma porotini e fesoʻotaʻi ma sela o ni mea taua e fuafua ai le eseesega o alava o maso o le tino. I le faʻaaogaina o la matou faiga proteomic i faʻataʻitaʻiga o gasegase e maua i le nematode myopathy, na matou faʻaalia atili ai o le ituaiga alava e faʻavae i le MYH e le o atagia atoatoa ai le eseesega o maso o le tino, aemaise lava pe a faʻalavelaveina le faiga. O le mea moni, e tusa lava po o le a le ituaiga alava e faʻavae i le MYH, o le nematode myopathy e mafua ai se suiga agai i alava vave ma itiiti ifo le oxidative.
Ua fa'avasegaina alava o maso o le tino talu mai le seneturi lona 19. O su'esu'ega talu ai nei a le omics ua mafai ai ona tatou amata malamalama i fa'amatalaga o le fa'aalia o ituaiga eseese o alava MYH ma a latou tali atu i fa'aosofiaga eseese. E pei ona fa'amatalaina iinei, o auala omics e iai fo'i le lelei o le sili atu o le maaleale mo le fuaina o fa'ailoga o ituaiga alava nai lo metotia masani e fa'avae i luga o antibody, e aunoa ma le fa'alagolago i le fuaina o se tasi (pe ni nai) fa'ailoga e fa'amatalaina ai se ituaiga alava o maso o le tino. Na matou fa'aogaina galuega fa'atino transcriptomic ma proteomic ma tu'ufa'atasia taunu'uga e su'esu'e ai le fa'atonutonuina o le transcriptional ma le post-transcriptional o le heterogeneity o alava i alava o maso o le tino o le tagata. O lenei galuega na mafua ai le le mafai ona fa'ailoaina alava mama 2X-type i le tulaga porotini i le vastus lateralis o la matou vaega o ali'i talavou maloloina. E ogatasi lenei mea ma su'esu'ega muamua o alava e tasi na maua ai le <1% alava mama 2X i le vastus lateralis maloloina, e ui lava e tatau ona fa'amaonia lenei mea i isi maso i le lumana'i. O le eseesega i le va o le iloa o alava toetoe lava mama 2X i le tulaga mRNA ma na'o alava fefiloi 2A/2X i le tulaga porotini e fenumiai. O le fa'aalia o le MYH isoform mRNA e lē o se circadian,67 o lo'o fa'ailoa mai ai e foliga mai e le mafai ona tatou "misia" le fa'ailo o le amataga o le MYH2 i alava e foliga mai e mama 2X i le tulaga RNA. O se tasi o fa'amatalaga e ono mafai, e ui lava e na'o se fa'ata'ita'iga, ae o eseesega i le porotini ma/po'o le mautu o le mRNA i le va o isoforms MYH. O le mea moni, e leai se alava vave e 100% mama mo so'o se isoform MYH, ma e le o manino pe o le a i'u ai le tulaga o le fa'aalia o le MYH1 mRNA i le va o le 70–90% i le tutusa o le MYH1 ma le MYH2 i le tulaga porotini. Peita'i, pe a mafaufau i le transcriptome atoa po'o le proteome, e mafai e le au'ili'iliga o le cluster ona fa'ailoa ma le mautinoa na'o ni vaega eseese se lua o lo'o fa'atusalia ai alava maso skeletal e lemu ma vave, e tusa lava po'o le a le latou fa'atulagaga sa'o o le MYH. E ogatasi lenei mea ma au'ili'iliga e fa'aaoga ai auala transcriptomic e tasi le nucleus, lea e masani ona fa'ailoa ai na'o ni vaega myonuclear se lua eseese. 68, 69, 70 E le gata i lea, e ui lava i suʻesuʻega proteomic na muamua atu na faʻamaonia ai alava ituaiga 2X, o nei alava e le faʻaputu eseese mai isi alava vave ma e naʻo sina vaega itiiti o porotini eseese e faʻaalia pe a faʻatusatusa i isi ituaiga alava e faʻavae i luga o le MYH. 14 O nei taunuuga e fautua mai ai e tatau ona tatou toe foʻi i le vaaiga o le amataga o le 20 seneturi i le faʻavasegaina o alava maso, lea na vaevaeina ai alava maso o le tino o le tagata e le o ni vasega eseese se tolu e faʻavae i luga o le MYH, ae i ni vaega se lua e faʻavae i luga o latou uiga faʻasolosolo ma le faʻapuʻupuʻu. 63
O le mea e sili ona tāua, e tatau ona mafaufau i le eseesega o le myofiber i le tele o itu. O suʻesuʻega muamua a le "omics" ua faʻasino i lenei itu, ma fautua mai ai o alava o maso skeletal e le fausia ni vaega eseese ae o loʻo faʻatulagaina i luga o se faʻasologa. 11, 13, 14, 64, 71 O iinei, matou te faʻaalia ai, i le faʻaopoopoga i eseesega i meatotino faʻamalosi ma metabolic o maso skeletal, e mafai ona iloa le eseesega o myofibers e ala i foliga e fesoʻotaʻi ma fegalegaleaiga o le sela-sela ma faiga faʻaliliu. O le mea moni, na matou maua le eseesega o ribosome i alava o maso skeletal e fesoasoani i le eseesega e tutoʻatasi mai ituaiga alava lemu ma vave. O le mafuaʻaga autū o lenei eseesega tele o myofiber, e tutoʻatasi mai ituaiga alava lemu ma vave, e le o manino, ae atonu e faʻasino i le faʻatulagaina faʻapitoa o le avanoa i totonu o maso fascicles e tali lelei i malosiaga ma avega faʻapitoa,72 fesoʻotaʻiga faʻapitoa o sela poʻo totoga ma isi ituaiga sela i le siosiomaga maso73,74,75 poʻo eseesega i gaioiga a le ribosome i totonu o myofibers taʻitasi. E moni, o le ribosomal heteroplasmy, pe ala i le paralogous substitution o le RPL3 ma le RPL3L pe i le tulaga o le 2′O-methylation o le rRNA, ua faʻaalia e fesoʻotaʻi ma le skeletal muscle hypertrophy76,77. O le tele-omic ma le spatial applications faʻatasi ai ma le functional characterization o myofibers taʻitasi o le a faʻalauteleina atili ai lo tatou malamalama i le biology o maso i le tulaga tele-omic78.
I le iloiloina o proteome o myofibers ta'itasi mai gasegase e maua i le nemaline myopathies, na matou fa'aalia ai fo'i le aoga, aoga, ma le fa'aogaina o le proteomics myofiber ta'itasi e fa'amalamalama ai le pathophysiology fa'aklinikal o maso skeletal. E le gata i lea, i le fa'atusatusaina o la matou galuega i le au'ili'iliga o le proteomic i le lalolagi atoa, na mafai ai ona matou fa'aalia o le proteomics myofiber ta'itasi e maua ai le loloto tutusa o fa'amatalaga e pei o le proteomics o a'ano i le lalolagi atoa ma fa'alauteleina lenei loloto e ala i le fa'atatauina o le heterogeneity interfiber ma le ituaiga myofiber. I le fa'aopoopoga i eseesega fa'amoemoeina (e ui lava i le fesuisuia'i) i le fua faatatau o le ituaiga fiber na matauina i le ACTA1 ma le TNNT1 nemaline myopathies pe a fa'atusatusa i tagata soifua maloloina,19 na matou matauina fo'i le oxidative ma le extracellular remodeling e tuto'atasi mai le MYH-mediated fiber type switching. Ua lipotia muamua le Fibrosis i TNNT1 nemaline myopathies.19 Peita’i, o la matou su’esu’ega e fa’avae i luga o lenei sailiga e ala i le fa’aalia fo’i o le si’itia o le maualuga o porotini e feso’ota’i ma le atuatuvale e fa’asa’olotoina mai fafo, e pei o annexins, e a’afia i faiga fa’aleleia o sarcolemmal, i myofibers mai gasegase e iai le ACTA1 ma le TNNT1 nemaline myopathies.57,58,59 I le fa’ai’uga, o le si’itia o le maualuga o le annexin i myofibers mai gasegase e iai le nemaline myopathy e ono fa’atusalia ai se tali atu o le sela i le toe fa’aleleia o myofibers ua matua’i atrophic.
E ui o lenei suʻesuʻega o loʻo faʻatusalia ai le suʻesuʻega sili ona tele o le tasi-alava atoa o maso-omics o tagata i le taimi nei, ae e le o se mea e leai ni tapulaʻa. Na matou vavaeʻeseina alava o maso skeletal mai se faʻataʻitaʻiga laʻititi ma tutusa o tagata auai ma se maso e tasi (le vastus lateralis). O le mea lea, e le mafai ona faʻateʻaina le i ai o ni vaega faʻapitoa o alava i ituaiga maso ma i tulaga ogaoga o le physiology o maso. Mo se faʻataʻitaʻiga, e le mafai ona matou faʻateʻaina le avanoa o se vaega o alava ultrafast (e pei o alava mama 2X) e aliaʻe mai i tagata tamoʻe saoasaoa ua aʻoaʻoina lelei ma/poʻo tagata taʻalo malolosi79 poʻo taimi o le le gaoioi o maso66,80. E le gata i lea, o le faʻatapulaʻaina o le tele o faʻataʻitaʻiga o tagata auai na taofia ai i matou mai le suʻesuʻeina o eseesega o itupa i le eseesega o alava, aua ua iloa e eseese le fua faatatau o ituaiga alava i le va o alii ma tamaitai. E le gata i lea, matou te leʻi mafai ona faia ni suʻesuʻega transcriptomic ma proteomic i luga o alava maso tutusa poʻo faʻataʻitaʻiga mai tagata auai tutusa. A o matou faʻaauau pea ona faʻaleleia atili auʻiliʻiliga o le single-cell ma le single-myofiber e faʻaaoga ai le auʻiliʻiliga omics e maua ai le faʻaaogaina o faʻataʻitaʻiga e matua maualalo lava (e pei ona faʻaalia iinei i le auʻiliʻiliga o alava mai gasegase e maua i le mitochondrial myopathy), o le avanoa e tuʻufaʻatasia ai auala e tele-omics (ma galuega) i totonu o alava maso e tasi ua manino mai.
I le aotelega, o a matou faʻamaumauga e faʻailoa ma faʻamatalaina ai mafuaʻaga o le eseesega o maso o le skeletal i le faʻaliliuga ma le faʻaliliuga pe a uma ona faʻaliliuina. Aemaise lava, matou te tuʻuina atu faʻamaumauga e luʻitauina ai se talitonuga tuai i le physiology o maso o le skeletal e fesoʻotaʻi ma le faʻamatalaga masani a le MYH o ituaiga o alava. Matou te faʻamoemoe e toe faʻafouina le finauga ma toe mafaufau i lo matou malamalama i le faʻavasegaina ma le eseesega o alava o maso o le skeletal.
E sefulufa tagata auai mai le itupa papa’e (12 alii ma le 2 tamaitai) na malilie e auai i lenei su’esu’ega. Na faamaonia le su’esu’ega e le Komiti o Amioga Mama a le Falema’i o le Iunivesite o Ghent (BC-10237), na tausisia le Folafolaga a Helsinki i le 2013, ma na resitalaina i le ClinicalTrials.gov (NCT05131555). O uiga lautele o tagata auai o lo’o tu’uina atu i le Fa’aopoopoga o le Laulau 1. Ina ua mae’a ona maua le maliega tu’ugutu ma tusitusia, na faia ai se su’esu’ega fa’afoma’i a’o le’i fa’aaofiaina mulimuli i le su’esu’ega. E laiti tagata auai (22–42 tausaga), e malolosi (leai ni fa’afitauli fa’afoma’i, leai se tala’aga o le ulaula), ma e feololo le malosi fa’aletino. O le maualuga o le fa’aaogaina o le okesene na fuafuaina e fa’aaoga ai se la’asaga ergometer mo le iloiloina o le malosi fa’aletino e pei ona fa’amatalaina muamua. 81
Sa aoina fa'ata'ita'iga o le biopsy o maso i le taimi e malolo ai ma i le tulaga anapogi fa'atolu, e 14 aso le va. Talu ai ona o nei fa'ata'ita'iga sa aoina o se vaega o se su'esu'ega tele, sa 'ai e tagata auai le placebo (lactose), o se H1-receptor antagonist (540 mg fexofenadine), po'o se H2-receptor antagonist (40 mg famotidine) i le 40 minute a'o le'i faia le biopsy. Sa matou fa'aalia muamua e le afaina i nei histamine receptor antagonists le malosi o maso o le skeletal i le taimi e malolo ai81, ma e leai se fa'aputuga e feso'ota'i ma le tulaga na matauina i a matou ata o le pulea lelei (Ata Fa'aopoopo 3 ma le 6). O se taumafataga fa'atulagaina (41.4 kcal/kg mamafa o le tino, 5.1 g/kg mamafa o le tino carbohydrate, 1.4 g/kg porotini mamafa o le tino, ma le 1.6 g/kg mamafa o le tino ga'o) sa tausia mo le 48 itula a'o le'i faia aso ta'itasi o le fa'ata'ita'iga, ma o se taumafataga o le taeao fa'atulagaina (1.5 g/kg mamafa o le tino carbohydrate) sa 'ai i le taeao o le aso o le fa'ata'ita'iga. I lalo o le vai fa'agase i le lotoifale (0.5 ml 1% lidocaine e aunoa ma le epinephrine), na maua ai biopsies o maso mai le maso vastus lateralis e fa'aaoga ai le percutaneous Bergström aspiration.82 Na vave ona fa'apipi'iina fa'ata'ita'iga o maso i le RNA ma teuina i le 4°C se'ia o'o i le taimi e tipi ai lima o alava (e o'o atu i le 3 aso).
O fusi myofiber fou ua vavae ese na fa'aliliuina i totonu o se RNAlater medium fou i totonu o se ipu fa'atupuina. Ona tipi ese lea o myofibers ta'itasi i le lima e fa'aaoga ai se stereomicroscope ma ni tweezers manifinifi. E luasefululima alava na tipi ese mai biopsy ta'itasi, ma fa'aeteete i le filifilia o alava mai vaega eseese o le biopsy. A mae'a ona tipi ese, ona fa'asusu mālie lea o alava ta'itasi i le 3 μl o le lysis buffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) o lo'o i ai le proteinase K ma le DNase enzymes e aveese ai porotini ma le DNA e le mana'omia. Ona amata lea o le lysis o le sela ma le aveeseina o le porotini/DNA e ala i le vortexing pu'upu'u, fa'ata'amilomilo le vai i totonu o se microcentrifuge, ma fa'asusu i le vevela o le potu (10 minute). Ona fa'asusu lea o le lysate i totonu o se thermal cycler (T100, Bio-Rad) i le 37°C mo le 5 minute, 75°C mo le 5 minute, ona teuina loa lea i le -80°C se'ia o'o i le fa'agasologa atili.
Sa saunia faletusi RNA polyadenylated e fetaui ma le Illumina mai le 2 µl o le myofiber lysate e faʻaaoga ai le QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). E mafai ona maua auala auiliili i le tusi lesona a le kamupani gaosi. E amata le faagasologa i le faʻasologa muamua o le cDNA e ala i le faʻaliliuga faʻafeagai, lea e faʻaofi ai faʻailoga molecular tulaga ese (UMIs) ma faʻailoga i1 faʻapitoa mo faʻataʻitaʻiga e faʻamautinoa ai le tuʻufaʻatasia o faʻataʻitaʻiga ma faʻaitiitia ai le eseesega faʻatekinolosi i le taimi o le faʻagasologa i lalo. Ona tuʻufaʻatasia lea o le cDNA mai le 96 myofibers ma faʻamamāina i ni beads magnetic, a maeʻa ona aveese lea o le RNA ma faia le faʻasologa lona lua e faʻaaoga ai ni primers faʻafuaseʻi. E faʻamamāina le faletusi i ni beads magnetic, faʻaopoopo pine i5/i7 faʻapitoa mo le vaitaʻele, ma faʻateleina le PCR. O le laʻasaga faʻamamāina mulimuli e maua ai faletusi e fetaui ma le Illumina. O le lelei o le vaitaʻele taʻitasi o faletusi na iloiloina e faʻaaoga ai le High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
E fa'avae i luga o le fa'atusatusaga o le Qubit, na fa'aopoopoina atili ai vaega i le tutusa o le maualuga (2 nM). Ona fa'asologa lea o le vaega na maua i luga o le meafaigaluega NovaSeq 6000 i le tulaga masani e fa'aaoga ai le NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nucleotides) fa'atasi ai ma le 2 nM loading (4% PhiX).
O la matou paipa e faʻavae i luga o le paipa auʻiliʻiliga faʻamaumauga a le Lexogen's QuantSeq Pool (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Na muamua aveese faʻamaumauga i le bcl2fastq2 (v2.20.0) e faʻavae i luga o le faʻasinomaga i7/i5. Ona aveese lea o le Faitau 2 i le idemux (v0.1.6) e faʻavae i luga o le faʻataʻitaʻiga o le barcode i1 ma faʻasologa o le UMI na aveeseina i le umi_tools (v1.0.1). Ona tipiina lea o faitauga i le cutadapt (v3.4) i ni taʻamilosaga se tele e aveese ai faitauga pupuu (<20 le umi) poʻo faitauga e naʻo faʻasologa o adapter. Ona faʻatulagaina lea o faitauga i le genome o le tagata e faʻaaoga ai le STAR (v2.6.0c) ma faʻasino faila BAM i le SAMtools (v1.11). Na aveese faitauga faalua e faʻaaoga ai le umi_tools (v1.0.1). Mulimuli ane, na faia le faitauina o le faʻatulagaina e faʻaaoga ai le featureCounts i le Subread (v2.0.3). Sa faia le puleaina o le lelei e faʻaaoga ai le FastQC (v0.11.9) i ni nai laʻasaga ogatotonu o le paipa.
O isi fa'agasologa ma fa'aaliga uma o le bioinformatics na fa'atinoina i le R (v4.2.3), e fa'aaoga ai le fa'agasologa o le Seurat (v4.4.0). 83 O le mea lea, o tau ta'itasi o le UMI ma matrices metadata na liua i mea faitino Seurat. O genes na fa'aalia i lalo ifo o le 30% o alava uma na aveeseina. O fa'ata'ita'iga maualalo le lelei na aveeseina e fa'atatau i le tulaga maualalo o le 1000 tau UMI ma le 1000 genes na iloa. I le iuga, e 925 alava na pasia la'asaga uma o le fa'amamaina o le lelei. O tau o le UMI na fa'atulagaina e fa'aaoga ai le metotia Seurat SCTransform v2, 84 e aofia ai foliga uma e 7418 na iloa, ma o eseesega i le va o tagata auai na toe fa'afo'isia. O metadata talafeagai uma e mafai ona maua i le Supplementary Dataset 28.